Pewarnaan Benda-Benda Mikroskopik

Semua zat-zat pewarnaan bakteri adalah produk sintetik, misalnya za-zat warna analin. Meskipun zat-zat warna sintetik bervariasi dalam sifat-sifat kimia dan sifat-sifat pewarnaannya, tetapi untuk tujuan praktek maka zat-zat warna dibagi ke dalam dua grup, yaitu 1) acid dyes (zat-zat warna sifat asam), 2) basic dyes (zat-zat warna sifat basa/alkalis).
Bentuk garam daripada zat-zat warna tersebut adalah lebih muda melarut, penetrasi lebih baik dan warna lebih permanen. Acid dyes (zat warna asam) sifat warnanya disebabkan oleh anion, sedangkan basic dyes (zat warna basa) disebabkan oleh kation.


Akan tetapi, reaksi sesungguhnya dari suatu larutan zat warna (dalam aqua) adalah tergantung pada beberapa faktor sehingga acid dyes bisa bereaksi basa, sedangkan basic dyes bisa bereaksi asam.
Basic dyes mempunyai afinitas paling besar terhadap inti sel, barangkali karena sifat asam daripada material inti, sedangkan acid dyes mempunyai tendensi yang lebih kuat untuk berkombinasi dengan sitoplasma.

Jenis pewarnaan:
- Metode pewarnaan sederhana: Suatu metode pewarnaan umum dimana dapat digunakan beberapa larutan tunggal zat warna dengan tujuan untuk melihat bentuk-bentuk sel-sel bakteri.
- Metode pewarnaan negatif: suatu metode pewarnaan umum dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatarbelakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk yang kosong tak berwarna (negatif)..

Lima metode pewarnaan spesial
a. Metode pewarnaan Gram
Kegunaannya : - untuk melihat/mengamati bentuk-bentuk sel-sel bakteri
- untuk mengetahui sifat reaksi pewarnaan bakteri, apakah negatif- gram (berwarna merah) atau positif-gram (berwarna biru).

b. Metode pewarnaan tahan asam (acid-fast staining)
Kegunaannya : - untuk melihat/mengamati bentuk-bentuk sel-sel bakteri yang tahan
pewarnaan asam, yang dengan pewarnaan-pewarnaan ini berwarna merah sedangkan bakteri lain berwarna biru.

c. Metode pewarnaan Fulton
Kegunaan : - untuk mendemonstrasikan adanya spora di dalam sel vegetatif dari
genus bacillus dan genus Clestridium.
- dengan pewarnaan fulton inii, spora berwarna hijau, sedang sel vegetatif berwana pink

Metode pewarnaan Hiss
Kegunaan : - untuk melihat/mengamati kapsul dari spesies bakteri tertentu.
- dengan perwarnaan hiss, kapsul akan berwarna faint pink (merah jambu pucat), sedang sel bakteri berwarna ungu tua.


Dua kelompok spesimen/bahan pemeriksaan yang bisa digunakan dengan metode-metode pewarnaan tersebut:

a. Spesimen Klinik:
1). Cair (liquid) : - urine
- transudat
- Eksudat
- Cerebro spinal fluid
- Synovial fluid
- dll

2). Semi/non-liquid : - septum
- pus
- feces
- sekret (mata, hidung, vagina dll)

b. Spesimen non-klinik
1). Cair (liquid) : - suspensi bakteri
- biakan bakteri dalam medium cair
2). Non-liquid : - biarkan bakteri pada pembenihan padat (ditabung atau
lempeng petri)

Cara membuat preparat/sediaan:
a. Spesifik klinik cair (liquid)
- kocok spesimen dalam tabung/botolnya agar tercampur baik.
- Pipet sejumlah volume (5 – 10 ml) spesimen ke dalam tabung centrifuge
- Putarselama 10 menit dengan kecepatan 3 x 103 rpm
- buang supernatan dan buat smear dari defesitnya pada sebuah objek gelas yang kering dan bersih.
- keringkan smear di udara dan kemudian lidah apikan (flaming) beberapa kali pada nyala pembakar bunsen atau lampu spirtus guna lebih melekatkan smear pada permukaan gelas dan mematikan mikroba.
- sediaan/preparat siap untuk diubar

b. Spesimen klinik non-liquid
- dengan sengklit yang steril (sebelumnya sampai memijar pada nyala lampu spirtus), ambil spesimen secukupnya kemudian buatlah smear pada sebuah objek gelas yang bersih dan kering.
- usahakan smear itu setipis mungkin
- keringkan di udara dan kemudian lidahapikan beberapa kali pada nyala bunsen
- preparat siap diubar.

c. Spesimen non-klinik cair
- dengan sengkli steril ambil sedikit biakan cair dari tabung dan buat smear setipis mungkin pada objek gelas yang bersih dan kering.
- keringkan di udara dan kemudian lidah apikan beberapa kali pada nyala lampu spirtus atau pembakar bunsen.
- sediaan/preparat siap diubar


Spesimen non-klinik non-liquid
- dengan sedikit steril ambil 1-2 koloni dari plate solid culture medium atau sedikit pertumbuhan dari tabung pembenihan agar miring dan suspensikan dalam aquadest pada permukaan sebuah objek gelas yang bersih dan kering.
- Buatlah smear dengan suspensi tersebut setipis mungkin
- Keringkan di udara dan kemudian lidahapikan beberapa kali pada nyala lampu spirtus atau pembakar bunsen
- sediaan/preparat siap diubar

Teknik
a. Pewarnaan Sederhana
- warnai smear 3 – 4 menit dengan salah satu larutan zat warna untuk metode pewarnaan sederhana.
- cuci preparat dengan air kran mengalir
- Keringkan di udara (jangan dilidahapikan pada bunsen)
- Periksa di bawah mikroskop cahaya:
* Pertama pakailah lensa okuler 10 dan lensa objektif 10 untuk melokalisasi bagian smear yang baik (tidak tebal, sel-sel bakteri tidak bertumpuk atau bertindihan)
* tetesi imersion oil bagian smear yang baik tersebut
* pakailah lensa objektif 100 untuk mengamati sel-sel bakteri.

b. Pewarnaan negatif
- Suspensi bakteri dicampur dengan larutan zat warna sama banyak (masing-masing 1 lop penuh) pada permukaan sebuah objek gelas yang bersih dan kering, ratakan sehingga menjadi smear yang tipis.
- keringkan di udara dan selajutnya periksa di bawah mikroskop cahaya seperti tersebut di atas.

c. Pewarnaan gram
- warnai smear selama 1 menit dengan larutan ammonium oksalat kristal violet
- cuci dengan air kran mengalir 2 detik
- celupkan 1 menit dalam larutan lugol
- cuci dengan air kran mengalir dan lap kering
- lunturkan setengah menit di dalam alkohol 95% dengan agitasi perlahan-lahan dan lap kering
- counterstain 10 detik dalam larutan safranin
- cuci di air keran mengalir
- keringkan dan periksa di bawah mikroskop cahaya seperti tercantum pada pewarnaan sederhana
Catatan: oleh karena sifat positif-gram atau negarif gram dari bakteri tergantung pada komposisi kimia atau integritas dinding sel bakteri dan kemantapan hal ini tergantung pula pada beberapa faktor (faktor umur, nutrisi, suhu pertumbuhan dan lain-lain), maka bisa terjadi hal yang sebaliknya. Dianjurkan untuk pewarnaan gram digunakan biakan yang berumur 18-24 jam.

Sumber: anonim