Metode Parafin untuk Histologi

Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode ini.

Kebaikan-kebaikan metode ini ialah sebagai berikut. Irisan dapat jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin. Dengan menggunakan metode beku, tebal irisan rata-rata di atas 10 mikron, tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapati rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah, bila menggunakan metode ini. Prosesnya jauh lebih cepat dibandingkan metode seloidin.



Kejelekannya ialah sebagai berikut. Jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar ensim-ensim akan larut dengan metode ini.

Urutan-urutan kerja pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin: fiksasi: pencucian (washing); dehidrasi; penjernihan (clearing); infiltrasi parafin; penanaman (embedding); penyayatan (section); penempelan (affiksing); deparafinasi; pewarnaan (staining); penutupan (mounting).
Setelah hewan dibunuh, segera diambil organ-organ yang diperlukan untuk segera difiksasi. Kalau diperlukan, sebelum difikasisi dicuci dulu dengan larutan garam fisiologis. Oleh karena itu sebelum fiksasi dimulai, siapkan dulu alat-alat dan kemikalia yang diperlukan.
Langkah yang kedua adalah pencucian. Pencucian di sini dimaksudkan untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan, setelah proses fiksasi selesai. Sebenarnya untuk setiap langkah dalam metode mikroteknik memerlukan penelitian dan kesabaran. Tanpa ketelitian dan kesabaran akan didapatkan hasil yang tidak diharapkan. Seperti halnya pada langkah fiksasi dan pencucian ini, bila dikerjakan dengan tergesa-gesa nanti akan didapatkan hasil irisan-irisan yang pecah dan mudah patah. Bila pencucian tidak sempurna, ini berarti masih terdapat molekul-molekul fiksatif yang tertinggal di dalam jaringan.
Molekul-molekul ini tentu saja akan menjadi penghalang untuk proses-proses lebih lanjut. Oleh karena itu pencucian harus dilakukan beberapa kali dengan cermat dan teliti. Misalnya fiksatif yang digunakan adaah larutan boin, dimana laurtan inin mengandung picric acid yang mudah membentuk kristal, maka untuk pencuciannya digunakan alkohol 70% yang diganti berkali-kali hingga warna kuning hilang.
Langkah selanjutnya adalah: dehidrasi. Langkah ini dilakukan setelah proses pencucian selesai. Proses ini dimaksudkan untuk menarik air yang terdapat di dalam jaringan agar nantinya seluruh ruangan antar sel dalam jaringan dapat diisi oleh molekul-molekul parafin. Seperti telah diketahui, bahwa jumlah kandungan air yang terdapat di dalam jaringan adalah besar; dan ini harus dihilangkan dari jaringan apabila jaringan akan dibawa ke parafin. Hal ini mudah dimengerti karena air tidak dapat bercampur dengan parafin.
Dehidran yang paling banyak digunakan adalah alkohol, yang biasanya dimulai dari alkohol persentase rendah kemudian setingkat demi setingkat menuju ke alkohol persentase tinggi (alkohol absolute). Hal ini dilakukan untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan yang tiba-tiba terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna, berarti masih ada molekul air di dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini, dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukkan ke zat penjernih nanti.
Setelah dehidrasi, segera lakukan proses penjernihan. Bila proses dehidrasi tidak sempurna, jaringan tidak akan menjadi transparan, walaupun jaringan sudah ditinggal lama di dalam zat penjernih. Jika terjadi keadaan demikian, jaringan harus dikembalikan ke dalam dehidran. Misalnya dehidran alkohol, maka jaringan harus dikembalikan lagi ke alkohol absolut untuk beberapa saat. Sebenarnya bila proses dehidrasi sempurna, proses penjernihan hanya memakan waktu beberapa menit saja. Clearing atau disebut juga dealkoholiasi bila dehidrannya alkohol. Proses ini sebenarnya dimaksudkan untuk menarik alkohol atau dehidran lain dari dalam jaringan, agar nantinya dapat digantikan oleh molekul parafin. Zat penjernih yang akan dipakai di dalam metode parafin hendaklah dipilih zat penjernih yang dapat bercampur baik dengan alkohol atau dehidran lain, tetapi juga dapat bercampur baik dengan parafin.
Apabila proses penjernihan diperkirakan sudah sempurna, selanjutnya dapat dimulai proses infiltrasi parafin. Sebelum dimulai proses ini, hendaklah dipilih parafin-parafin yang titik cairnya berkisar 50-560C. Parafin yang titik cairnya rendah misalnya 56-48oC dapat juga dipakai, bila dicampur dengan parafin yang titik cairnya tinggi, milasnya 60-650C. Proses infiltrasi parafin ini, seluruhnya dikerjakan di dalam oven. Suhu oven diatur kira-kira 56oC. Kalau tidak ada oven, dapat juga digunakan alat lain yang dapat dibuat sendiri, yaitu sebuah dandang dari seng atau aluminium di mana di dalamnya diberi lampu listrik 60 Watt.
Dalam proses infiltrasi parafin, sebaiknya jaringan jangan dimasukkan langsung dari zat penjernih ke parafin murni, tetapi sebelum parafin murni jaringan dimasukkan dulu ke dalam campuran zat penjernih parafin murni dengan volume dalam perbandingan yang sama. Waktu yang diperlukan oleh suatu jaringan di dalam campuran zat parafin murni, tidak perlu terlalu lama cukup berkisar 10-30 menit saja, tergantung dari besar/kecilnya jaringan. Hal ini dilakukan untuk menghindari perubahan lingkungan secara mendadak terhadap jaringan tersebut. Karena perubahan-perubahan yang terjadi sangat mendadak menimbulkan kerugian yang sangat besar terhadap jaringan, misalnya jaringan akan mengkerut.

Untuk langkah berikutnya, bisa cari buku Metode Pewarnaan